生物實驗室系列--現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及實驗技巧（第二版）

本書第一版廣受讀者歡迎。新版延續(xù)第一版內(nèi)容特色，系統(tǒng)介紹現(xiàn)代分子生物學(xué)各種傳統(tǒng)和新型的實驗技術(shù)，涵蓋核酸提取技術(shù)、目的基因的獲取及鑒定技術(shù)、載體的構(gòu)建和鑒定、細菌轉(zhuǎn)化與細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、外源基因表達的鑒定、報告基因分析、差異基因表達譜分析、蛋白質(zhì)-核酸相互作用技術(shù)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)、微生物體內(nèi)同源重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)、基因編輯技術(shù)、流式細胞術(shù)實驗方法、干細胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化、微RNA的構(gòu)造及實驗技術(shù)、長鏈非編碼RNA研究實驗技術(shù)、非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線分析工具。
新版增加了CRISPR基因編輯技術(shù)、長鏈非編碼RNA研究實驗技術(shù)等新內(nèi)容，并對非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線分析工具一章進行重寫。和第一版一樣，實驗方案部分強調(diào)對實驗結(jié)果作具體分析，每個實驗結(jié)果一般附圖（照片），圖中設(shè)陰陽性對照，對照圖對實驗結(jié)果進行詳細分析，使讀者對實驗結(jié)果一目了然，還指出了每個技術(shù)的難點和解決辦法。
本書是生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)實驗室的案頭實驗操作工具書，可供從事生命科學(xué)研究的碩士、博士等科技工作者和教學(xué)一線教師日常查閱參考。

葉棋濃，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院某所科技委主任，研究員，博士生導(dǎo)師。國家杰出青年科學(xué)基金獲得者，享受國務(wù)院政府特殊津貼。中國生物工程學(xué)會副秘書長、中國生物工程學(xué)會醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)委員會主任委員、中國分析測試協(xié)會標記免疫分析專業(yè)委員會副主任委員。Frontiers in Cell and Developmental Biology和Frontiers in Oncology雜志副主編，Science Bulletin雜志特邀編委。主要從事腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥相關(guān)基因功能及機制研究，發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因和非編碼RNA，為腫瘤的診斷和治療提供候選靶標。以通訊作者在Cancer Cell、Nature Communications、Science Advances、Journal of Clinical Investigation、Advanced Science、Science Bulletin、STTT等SCI雜志上發(fā)表文章90余篇。獲北京市科學(xué)技術(shù)一等獎1項，軍隊科技進步二等獎1項。

一版廣受歡迎，新版維持一版內(nèi)容特色。系統(tǒng)介紹現(xiàn)代分子生物學(xué)各種傳統(tǒng)和新型的實驗技術(shù)，新版增加了CRISPR基因編輯技術(shù)、長鏈非編碼RNA研究實驗技術(shù)等新內(nèi)容，并對非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線工具一章進行重寫。實驗方案部分強調(diào)對實驗結(jié)果作具體分析，每個實驗結(jié)果都附圖（照片），圖中設(shè)陰陽性對照，對照圖對實驗結(jié)果進行詳細分析，使讀者對實驗結(jié)果一目了然，還指出了每個技術(shù)的難點和解決辦法。 分子生物學(xué)工作者案頭常備實驗手冊工具書。

分子生物學(xué)是從分子水平對生物學(xué)進行研究的科學(xué)，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的誕生使生命科學(xué)的發(fā)展得以大力推進，分子生物學(xué)技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林業(yè)、制藥學(xué)等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)是目前從事生命科學(xué)研究的重要手段，是每個從事這個領(lǐng)域的科技工作者都必須熟練掌握的基本技術(shù)。
編寫本書的目的在于彌補以往的書籍中對實驗結(jié)果分析的缺乏，本書強調(diào)對實驗結(jié)果作具體的分析，如需附結(jié)果的圖或照片，圖中要有陰陽性對照等。結(jié)合照片分析研究結(jié)果，列舉實驗中經(jīng)常遇到的問題及可能的解決方法是本書的特色。讀者閱讀后在實驗結(jié)果解讀和改進實驗方法等方面都能豁然開朗。此外，本書在編寫的內(nèi)容上也力求全面，第一到六章包括分子克隆所需的技術(shù)，從基因的提取、克隆到目的基因的表達；第七到十三章分別介紹了報告基因分析、差異基因表達譜分析、蛋白質(zhì)與核酸/蛋白質(zhì)的相互作用、微生物體內(nèi)同源重組技術(shù)、基因編輯和轉(zhuǎn)基因動物等技術(shù)；最后五章則對流式細胞術(shù)、干細胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化技術(shù)、微RNA、長鏈非編碼RNA，以及非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線分析工具進行了介紹。本書適合所有從事生命科學(xué)研究的科技工作者、教師和研究生使用。
本書大多由工作在第一線的青年科技工作者和博士研究生撰寫，由于時間倉促，加上編者水平有限，書中難免有疏漏和不妥之處，懇請讀者指正。

葉棋濃
軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所
2024年4月于北京

第一章分子生物學(xué)技術(shù)概述1
一、引言1
二、目的基因的獲取1
三、克隆載體的選擇2
四、載體的轉(zhuǎn)化2
五、重組子的篩選3
六、基因表達4
七、生物工程技術(shù)的應(yīng)用5
參考文獻6

第二章核酸提取技術(shù)7
第一節(jié)質(zhì)粒DNA的提取7
一、引言7
二、堿裂解法小量質(zhì)粒提取所需的儀器、材料及基本步驟8
三、Promega質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒操作程序9
四、注意事項9
五、實驗結(jié)果說明10
六、疑難解析10
第二節(jié)基因組DNA的提取12
一、引言12
二、從植物組織提取基因組DNA13
三、從動物組織提取基因組DNA14
四、細菌基因組DNA的制備14
五、用DNA提取試劑盒從全血和組織中提取基因組DNA15
六、注意事項17
七、實驗結(jié)果說明17
八、疑難解析18
第三節(jié)RNA的提取19
一、引言19
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟20
三、實驗結(jié)果說明24
四、疑難解析24
參考文獻25

第三章目的基因的獲取及鑒定技術(shù)26
第一節(jié)普通PCR26
一、普通PCR的基本概念和原理26
二、普通PCR技術(shù)的實驗方法27
三、疑難解析32
第二節(jié)實時熒光定量PCR33
一、實時熒光定量PCR的基本概念和原理33
二、實時熒光定量PCR的定量方法36
三、實時熒光定量PCR的實驗方法42
四、實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用47
五、疑難解析53
第三節(jié)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法快速檢測病原菌55
一、引言55
二、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增的原理57
三、實驗設(shè)計思路和基本步驟59
四、實驗結(jié)果66
五、疑難解析69
六、小結(jié)70
參考文獻72

第四章載體的構(gòu)建和鑒定76
第一節(jié)克隆載體76
一、pBR322載體76
二、pUC8——一種Lac選擇型質(zhì)粒78
三、pGEM3Z——克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄78
四、柯斯質(zhì)粒載體78
第二節(jié)表達載體79
一、原核表達載體80
二、真核表達載體82
第三節(jié)載體構(gòu)建中的關(guān)鍵工具和步驟87
一、關(guān)鍵工具87
二、常規(guī)克隆關(guān)鍵步驟89
三、同源重組克隆關(guān)鍵步驟91
第四節(jié)載體構(gòu)建的應(yīng)用舉例92
一、常規(guī)克隆實驗材料92
二、常規(guī)克隆實驗方法93
三、同源重組克隆實驗材料97
四、同源重組克隆實驗方法98
五、疑難問題解析100
參考文獻100

第五章細菌轉(zhuǎn)化與細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)102
第一節(jié)細菌轉(zhuǎn)化102
一、基本原理102
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟103
三、實驗結(jié)果及分析104
四、疑難解析104
第二節(jié)細胞轉(zhuǎn)染105
一、基本原理106
二、實驗設(shè)計和基本步驟108
三、實驗結(jié)果及分析110
四、疑難解析111
參考文獻112

第六章外源基因表達的鑒定113
第一節(jié)Northern Blot113
一、引言113
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟113
三、實驗結(jié)果說明116
四、疑難解析117
第二節(jié)RT-PCR117
一、引言117
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟117
三、實驗結(jié)果說明120
四、疑難解析120
第三節(jié)Western Blot121
一、引言121
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟121
三、實驗結(jié)果說明126
四、疑難解析126
第四節(jié)ELISA127
一、引言127
二、實驗設(shè)計思路和基本步驟129
三、實驗結(jié)果說明131
四、疑難解析131
參考文獻132

第七章報告基因分析134
第一節(jié)報告基因的定義和種類134
一、報告基因的定義134
二、常用的報告基因134
第二節(jié)應(yīng)用報告基因分析基因的轉(zhuǎn)錄活性135
一、實驗原理135
二、實驗設(shè)計和基本步驟136
三、實驗結(jié)果分析137
四、疑難解析140
第三節(jié)報告基因在動物活體成像中的應(yīng)用140
一、實驗原理140
二、實驗設(shè)計和基本步驟142
三、實驗結(jié)果分析143
四、疑難解析143
參考文獻145

第八章差異基因表達譜分析147
第一節(jié)基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析147
一、引言147
二、實驗基本步驟和注意事項147
三、雙向電泳實驗結(jié)果說明及疑難解析154
四、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析說明及疑難解析154
五、結(jié)語159
第二節(jié)基因芯片160
一、引言160
二、工作原理161
第三節(jié)基因芯片的制備163
一、概述163
二、探針的選擇和制備163
三、基因芯片基片的選擇和準備165
四、基因芯片的制作166
第四節(jié)基因芯片的檢測168
一、基因芯片的雜交和數(shù)據(jù)獲取168
二、基因芯片分析常用的軟件和數(shù)據(jù)庫169
第五節(jié)基因芯片的應(yīng)用170
一、基因芯片與病原微生物檢測170
二、基因芯片與腫瘤172
三、基因芯片與藥物研發(fā)174
四、結(jié)語176
參考文獻176

第九章蛋白質(zhì)-核酸相互作用技術(shù)178
第一節(jié)凝膠遷移實驗178
一、引言178
二、實驗設(shè)計與基本步驟179
三、實驗舉例與結(jié)果說明184
四、需要注意的問題186
第二節(jié)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)187
一、引言187
二、實驗基本步驟188
三、實驗舉例189
四、實驗注意事項192
第三節(jié)RNA沉降192
一、實驗基本原理192
二、實驗基本思路192
三、實驗舉例說明197
第四節(jié)RIP實驗198
一、實驗基本原理198
二、實驗思路199
三、注意事項200
四、實驗舉例說明201
參考文獻201

第十章蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)202
第一節(jié)運用酵母雙雜交技術(shù)篩選與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)202
一、引言202
二、實驗儀器及材料203
三、實驗設(shè)計流程204
四、實驗方法204
五、實驗結(jié)果說明210
六、疑難解析214
第二節(jié)GST沉降214
一、實驗基本原理214
二、實驗基本步驟215
三、實驗舉例217
四、實驗注意事項221
第三節(jié)免疫共沉淀222
一、引言222
二、實驗設(shè)計和基本步驟223
三、實驗結(jié)果舉例225
四、需要注意的問題227
第四節(jié)細胞共定位228
一、引言228
二、實驗設(shè)計和基本步驟228
三、實驗結(jié)果舉例說明229
四、實驗注意事項230
參考文獻231

第十一章微生物體內(nèi)同源重組技術(shù)232
第一節(jié)傳統(tǒng)的大腸桿菌體內(nèi)同源重組方法（RecA重組系統(tǒng)）232
一、引言232
二、利用RecA重組系統(tǒng)構(gòu)建痢疾桿菌hns基因插入突變體232
三、RecA重組系統(tǒng)構(gòu)建突變體的其他方法235
四、存在的問題和解決方法236
五、小結(jié)236
第二節(jié)Red/ET重組系統(tǒng)237
一、引言237
二、痢疾桿菌hns基因缺失突變體的構(gòu)建238
三、Red同源重組技術(shù)應(yīng)用策略241
四、應(yīng)用Gap-Repair克隆技術(shù)構(gòu)建pBR322-Red載體242
五、Red/ET重組系統(tǒng)的其他應(yīng)用244
六、小結(jié)245
參考文獻245

第十二章轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)247
第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物概述247
一、轉(zhuǎn)基因動物的概念247
二、轉(zhuǎn)基因動物的分類247
三、轉(zhuǎn)基因動物的命名248
四、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的基本原理249
五、轉(zhuǎn)基因動物的安全性和倫理學(xué)問題250
六、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的發(fā)展概況251
第二節(jié)顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動物252
一、儀器設(shè)備及材料和試劑252
二、實驗動物準備253
三、轉(zhuǎn)基因動物制備方法254
四、影響轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生效率的因素257
第三節(jié)利用ES細胞制備轉(zhuǎn)基因動物258
一、ES細胞的研究歷史258
二、ES細胞的生物學(xué)特性258
三、ES細胞分離培養(yǎng)的基本方法259
四、ES細胞的遺傳修飾263
五、轉(zhuǎn)基因動物制備270
參考文獻271

第十三章基因編輯技術(shù)272
第一節(jié)基因打靶技術(shù)273
一、基因打靶技術(shù)的原理273
二、利用同源重組構(gòu)建基因打靶動物模型的基本步驟273
三、基因打靶的策略276
四、基因打靶的生物學(xué)意義和應(yīng)用前景287
第二節(jié)CRISPR/Cas9系統(tǒng)288
一、CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡介及其作用原理288
二、TypeⅡ CRISPR/Cas9系統(tǒng)289
三、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用舉例291
四、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用前景295
第三節(jié)CRISPR/Cas13系統(tǒng)296
一、CRISPR/Cas13系統(tǒng)的介紹296
二、實驗基本步驟296
三、注意事項298
四、實驗結(jié)果說明298
五、疑難解析300
參考文獻300

第十四章流式細胞術(shù)實驗方法305
一、引言305
二、實驗方法308
三、實驗結(jié)果分析313
四、流式細胞分析的質(zhì)量控制323
參考文獻325

第十五章干細胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化327
第一節(jié)人胎盤來源間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與純化327
一、引言327
二、材料、試劑與主要儀器設(shè)備328
三、實驗方法329
四、實驗結(jié)果332
五、注意事項337
第二節(jié)小鼠間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與純化338
一、引言338
二、骨髓法339
三、密質(zhì)骨法339
第三節(jié)人胚胎干細胞的培養(yǎng)348
一、引言348
二、實驗材料348
三、實驗方法348
四、注意事項352
第四節(jié)CD34+造血干細胞與CD14+單核細胞向樹突狀細胞的誘導(dǎo)分化353
一、引言353
二、實驗材料與方法354
三、實驗結(jié)果357
四、注意事項359
參考文獻359

第十六章微RNA的構(gòu)造及實驗技術(shù)364
第一節(jié)miRNA克隆364
一、材料與設(shè)備365
二、實驗方法365
三、疑難解析368
第二節(jié)miRNA Northern Blot368
一、材料與設(shè)備368
二、實驗方法369
三、疑難解析369
第三節(jié)miRNA原位雜交370
一、材料與設(shè)備370
二、實驗方法371
三、疑難解析371
第四節(jié)基于poly（A）加尾的miRNA RT-PCR372
一、材料與設(shè)備372
二、實驗方法373
三、疑難解析374
第五節(jié)miRNA功能研究375
一、miRNA表達檢測375
二、miRNA功能篩選鑒定376
三、miRNA靶基因鑒定377
四、miRNA非經(jīng)典功能378
第六節(jié)siRNA的構(gòu)造及實驗研究379
一、引言379
二、如何進行RNAi實驗381
三、常用RNAi實驗的基本步驟384
四、實驗結(jié)果說明388
五、疑難解析389
參考文獻390

第十七章長鏈非編碼RNA研究實驗技術(shù)392
第一節(jié)lncRNA克隆392
一、材料與設(shè)備393
二、實驗方法393
三、實驗注意事項396
第二節(jié)lncRNA Northern Blot396
一、材料與設(shè)備396
二、實驗方法396
三、實驗注意事項397
第三節(jié)lncRNA原位雜交398
一、材料與設(shè)備398
二、實驗方法398
三、實驗注意事項399
第四節(jié)lncRNA定量檢測400
一、材料與設(shè)備400
二、實驗方法400
三、實驗注意事項400
第五節(jié)lncRNA-蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)401
一、RNA pull-down鑒定特定lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)401
二、RIP鑒定特定蛋白質(zhì)結(jié)合的lncRNA免疫沉淀技術(shù)404
三、CLIP鑒定蛋白質(zhì)與lncRNA的結(jié)合位點405
四、ChIRP鑒定與lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)/DNA408
參考文獻412

第十八章非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線分析工具介紹414
第一節(jié)綜合性非編碼RNA數(shù)據(jù)庫414
一、概論414
二、非編碼RNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫415
三、小結(jié)425
第二節(jié)miRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測工具425
一、概論425
二、miRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫425
三、miRNA相關(guān)預(yù)測工具434
四、小結(jié)442
第三節(jié)rRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測工具442
一、概述442
二、rRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫442
三、rRNA相關(guān)預(yù)測工具448
四、小結(jié)449
第四節(jié)sRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測工具450
一、概述450
二、sRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫450
三、sRNA靶標相關(guān)預(yù)測工具452
四、小結(jié)454
第五節(jié)siRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫454
一、概述454
二、siRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫454
第六節(jié)tRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測工具460
一、概述460
二、tRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫460
三、tRNA相關(guān)預(yù)測工具470
四、小結(jié)472
第七節(jié)snoRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測工具472
一、概述472
二、snoRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫472
三、snoRNA相關(guān)預(yù)測工具473
四、小結(jié)476
第八節(jié)lncRNA及circRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫477
一、概論477
二、lncRNA及circRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫477
三、小結(jié)497
參考文獻498